介绍一篇发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，题目为“Detection of Epigenetically Important 5-Formylcytosine Modifications Using Novel Photoreactive Oligonucleotides Containing a Trioxsalen-Conjugated Guanosine”，通讯作者是日本东京科学大学的Asako Yamayoshi教授，课题组的主要研究方向包括核酸药物开发、表观遗传学等。

5-甲基胞嘧啶（5mC）是发生在DNA胞嘧啶上的一种重要的表观遗传修饰，其擦除的过程由TET家族酶催化，依次经历5hmC、5fC、5caC等中间体。近年研究表明，5fC可能不仅作为5mC擦除过程的中间体，也可能在基因表达、细胞分化和疾病发生中具有调控功能。然而，由于5fC在基因组中的含量极低（通常比5mC低3-4个数量级），其特异性检测一直面临挑战。因此，开发高选择性、高灵敏度的5fC检测工具对于理解其生物功能至关重要。因此，作者希望发展新型的光交联寡核苷酸探针，实现对5fC的特异性识别与检测。

补骨脂素（Psoralen）是呋喃香豆素类化合物，可以插入到DNA链中，并在365 nm紫外光照射下与嘧啶环发生[2+2]环加成反应。基于此，作者选择补骨脂素的衍生物三甲沙林（Trioxsalen）作为光交联基团，将其连接到G的C2’位点，得到两种光交联核苷，并合成了对应的寡核苷酸GPs-Oligo与GPs2-Oligo。

接下来，作者评估了探针对C、5mC、5hmC、5fC、5caC的光交联效率。结果表明，上述两种探针与作者此前开发的Ps-Oligo（Ps基团位于G的C5’）均对于5mC表现出高效交联，对于C、5hmC、5caC的交联效率较低。此外，只有GPs-Oligo能够以较强的程度与5fC发生光交联。作者也检测了各种环加成产物在254 nm紫外照射后发生逆环加成的效率，发现GPs-Oligo与5mC的交联产物会发生解离，而与5fC的交联产物保持稳定。

作者对GPs-Oligo及其互补链的晶体结构进行了解析，认为GPs-Oligo中较短的linker使三甲沙林基团在空间上更易于与5fC的甲酰基发生相互作用，由此实现对5fC的特异性标记。而对于5fC的交联产物在254 nm下稳定，作者认为可能是由于醛基与烯烃双键发生了额外的[2+2]环加成（即Paterno–Büchi反应），产物氧杂环丁烷的断键需要更高的能量。

基于上述的反应特性，作者开发了一种基于DNA芯片的5fC检测平台，即将氨基标记的GPs-Oligo固定在醛基修饰的芯片上，探针与目标DNA结合后，先后进行365 nm和254 nm的照射。结果显示，5fC信号在254 nm照射后得以保留，而5mC的信号显著减弱，从而实现对5fC的高信噪比检测。

总之，本文发展了一种基于光交联寡核苷酸的5fC检测方法，有望实现对这一表观遗传学修饰的特异性富集及研究。

本文作者：YAQ

责任编辑：LYC

DOI：10.1021/jacs.5c11463

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c11463