给大家分享的是近期发表在 Angewandte Chemie International Edition 的文章，标题为：“Chemoenzymatic Synthesis of Highly O-Glycosylated MUC7 Glycopeptides for Probing Inhibitory Activity against Pseudomonas aeruginosa Biofilm Formation”。其通讯作者是国科大杭州高等研究生药学院蓝乐夫教授，复旦大学基础医学院生物化学与分子生物学系李中华研究员以及中国科学院上海药物研究所李铁海研究员。
在本研究中，作者利用疏水性标签辅助肽合成和酶催化聚糖延伸联合使用的化学酶方法首次全合成了具有 9 个糖基化位点且不同糖型的 MUC7 糖肽，同时生物学评估发现其中唾液酸化的糖肽对铜绿假单胞菌生物膜的形成表现出更好的抑制活性。 粘蛋白是一大类具有可变串联重复序列的高度 O-糖基化蛋白，已被发现作为宿主防御屏障，以防止病原微生物的入侵。其中 MUC7 是一种小的可溶性和分泌性粘蛋白，广泛存在唾液和呼吸道中，在促进细菌清除和防止微生物入侵方面发挥着潜在作用。糖组学分析显示，MUC7 的 23 个氨基酸串联重复序列（TR）结构域包含 9 个糖基化位点，且几乎所有位点都被完全占据。这些位点中大多数具有末端唾液酸封端的聚糖结构糖基化修饰可能介导与细菌的相互作用。在机会性病原体铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染期间，粘蛋白相关的 O-聚糖介导与细菌的相互作用以减弱其毒力。鉴于 O-聚糖或糖缀合物对 P. aeruginosa 的影响进行了大量研究，可以设想呼吸道中高度 O-糖基化的 MUC7 糖肽可能在抗铜绿假单胞菌中发挥作用。然而，MUC7 糖肽的微异质性和结构复杂性使得从组织中分离来获得足够的糖肽成为一项艰巨的挑战，这严重阻碍了 O-糖基化 MUC7 肽对 P. aeruginosa 的精确生物功能阐明。因此，迫切需要结构明确的 MUC7 糖肽来深入了解它们在 P. aeruginosa 侵袭中的作用，促进潜在抗菌药物的开发。 合成复杂 O-糖肽的关键是获得像 Fmoc-Thr(α-Ac3GalNAc)-OH 和 Fmoc-Ser(α-Ac3GalNAc)-OH 这样的糖基化氨基酸构建模块。而这两种模块的制备需要立体选择性地构建 1,2-顺式-α糖苷键。于是在本文中，作者开发了一种实用的方法：利用 DTBS 导向的立体选择性糖苷化反应，可以从半乳糖胺盐酸盐出发，高效地合成两种糖基氨基酸（见方案 1）。有了糖基氨基酸构建模块后，作者将注意力集中在如何实现多糖基化 MUC7 的组装上。为了克服复杂糖肽的合成的困难和低效率，作者将长肽序列合理地分成三个片段 5-7 来组装 O-GalNAc 修饰的糖肽 4，具体合成步骤见方案 1。最后通过 C18 硅胶柱色谱和 HPLC 得到纯化的具有 9 个 O-GalNAc 修饰的目标糖肽 4。 方案 1 MUC7 的全合成路线
成功合成了 MUC7 糖肽 4 后，作者将注意力转向利用糖基转移酶催化聚糖延伸以制备具有不同糖型的复合糖肽 1-3（方案 2）。首先，糖肽 4 的 9 个 GalNAc 残基通过 β1,3-半乳糖基转移酶 1（C1GalT1）和尿苷-5′-二磷酸半乳糖（UDP-Gal）半乳糖基化，生成末端 Gal 修饰的糖肽 3。用 ESI-MS 监测反应，C18 小柱快速固相萃取以获得目标产物 3。依照该过程，利用 α1,2-岩藻糖基转移酶（FUT1）和鸟苷-5′-二磷酸-β-L-岩藻糖（GDP-Fuc）催化 3 得到岩藻糖基化糖肽 2。通过 α2,3-唾液酸转移酶（ST3Gal1）和胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac），可在 8 小时后检测到完全唾液酸化糖肽 1 的 MS 峰。 方案 2 酶催化合成 MUC7 糖肽 1-3
为了探索 MUC7 糖肽的生物活性，作者对具有不同糖基化的 MUC7 糖肽 1-4 对 P. aeruginosa PAO1 的抑制活性进行了评估。所有分析的化合物都能够有效抑制 PAO1 的生物膜形成（图 1）。值得注意的是，唾液酸化 MUC7 糖肽 1 对细菌生物膜生长的抑制作用优于其他糖肽，达到 44% 的抑制作用，表明唾液酸化可能是糖肽与 P. aeruginosa 相互作用的重要元素。不同糖基化的 MUC7 糖肽所表现出的效果差异表明由延长的聚糖链引起的 MUC7 糖肽上糖基化修饰的改变或其在水溶液中的理化性质（例如，溶解度和聚集度）的变化可能会影响/调节它们对 P. aeruginosa 的抑制作用。此外，为了排除化合物对细菌生长的影响，作者确定了相应的细菌时间-生长曲线，证明了抗生物膜活性与细菌生长抑制无关。 图 1 不同 MUC7 糖肽抑制 P.aeruginosa PAO1 生物膜形成的效果评估
总之，在本研究中作者通过高效的化学酶方法首次合成了具有各种复杂糖型的高度 O-糖基化修饰的 MUC7 糖肽。疏水标签辅助液相肽合成、分割偶联策略和酶催化的聚糖延伸相结合，可以简化具有多个糖基化位点和复杂糖型的糖肽的组装。这些结构定义明确的糖肽对 P. aeruginosa 生物膜形成的生物学评价表明独特的抑制活性是由 MUC7 糖肽上的不同糖型介导的，其中唾液酸化 MUC7 糖肽对细菌生物膜生长表现出明显的抑制作用。总之，高效的化学酶方法扩展了复杂糖肽合成的化学空间，唾液酸化 MUC7 糖肽有可能开发为针对 P. aeruginosa 感染的抗菌药物。 ———————— 本文作者：LJM 原文链接： https://doi.org/10.1002/anie.202424312
