推荐一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，标题为“One-Step Labeling Strategy for the Profiling of Multiple Types of Protein Glycosylation”。文章的通讯作者是来自中国科学院上海药物研究所的周虎老师和文留青老师，前者的主要研究方向是基于质谱的药物蛋白质组学研究，后者是糖化学生物学和糖类药物研究。

糖基化位点分析是糖科学领域的研究热点，因其作为探究蛋白质糖基化生物学功能的先决条件而备受关注。近年来，基于生物正交化学反应的两步标记策略已成为研究蛋白质糖基化的强有力工具。首先，单糖或糖核苷酸携带的叠氮基、炔基等生物正交反应基团，经由体内代谢途径或体外酶促反应被引入目标聚糖；随后，这些标记的聚糖通过生物正交反应与生物素基团或固相树脂实现连接。然而，这种标准做法常常标记效率过低，非特异性吸附以及成本较高。

为了解决上述问题，作者开发了一种一步到位的糖探针PNIPAM，其结构包括3个功能元件：1. 糖核苷酸（酶反应位点）2. 温敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物基团（PNIPAM，数均分子量Mn=10,000 Da，作为富集基团）3. 紫外光可切割基团。该探针的工作流程为：标记-富集-分级解离-检测。

在标记一步，作者首先使用唾液酸酶对原有糖肽的末端唾液酸酶进行切除，随后作者使用克隆并重组表达的PS2, 6ST唾液酸转移酶将类似唾液酸的探针标记上。

富集流程的原理为温度控制：当温度升至40℃时，标记的糖肽从溶液中析出，与未标记肽段实现分离。沉淀物在0℃条件下重新溶解。该过程避免了树脂的使用。在后续的过程中，作者实现了糖肽的分级释放：首先使用糖苷酶处理捕获物，释放的N-糖肽存在于上清液中O-糖肽及其他留在沉淀中。其次将上清与沉淀分离，对沉淀物使用356 nm紫外光照射，使O-糖肽解离释放。最终作者通过质谱分析释放的糖肽，并采用不同修饰策略进行数据库检索。

在使用人工合成的糖肽验证方法的可行性后，作者选取两种乳腺癌细胞系：低侵袭性的管腔型MCF7细胞和高侵袭性的三阴性MDA-MB-468细胞。经同样实验流程对两种细胞的糖肽修饰进行分析。结果显示MDA-MB-468的核心岩藻糖基化位点数量是MCF7的1.8倍，与既往报道中核心岩藻糖基化促进乳腺癌侵袭转移的结论一致。同时，数据显示MDA-MB-468中T/ST修饰糖肽更多而Tn/STn更少，提示该细胞系可能存在Tn/STn向T/ST结构的转化。STRING数据库蛋白互作网络分析显示，差异糖蛋白显著富集于：铁死亡、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、鞘脂代谢，提示糖基化可能通过调控这些生物学过程促进癌症侵袭。

此方法首次实现多种糖基化类型的同步富集分析，突破既往单类型研究局限。然而唾液酸转移酶特异性导致该方法仅能标记特定糖基化亚群，且分级释放过程会损失部分N-糖肽的延伸聚糖结构信息，不适用于完整糖肽分析。

本文作者：ZYH

责任编辑：WYQ

DOI：10.1021/acs.analchem.4c06400

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06400