分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Postproline Cleaving Enzymes also Show Specificity to Reduced Cysteine1文章的通讯作者为捷克科学院微生物研究所的Petr Man教授。
蛋白水解是蛋白质组学和基于质谱(MS)的蛋白质结构分析中的关键步骤，将蛋白质水解成更短的肽段，有助于质谱分析和数据处理，克服了完整蛋白质分析的局限性。胰蛋白酶(trypsin)能够特异性且高效地在精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)之后切割蛋白质，遗漏位点极少，产生可预测的肽段，且价格实惠，已成为蛋白质组学水解的黄金标准。然而，蛋白质组中存在具有不利赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)分布以及翻译后修饰的蛋白质，这些可能不易被胰蛋白酶有效水解。使用不同的酶可以提供更多的水解位点分布，有望增加蛋白质组的覆盖率，能够检测到更多种类的肽段和蛋白质。其中后脯氨酸切割酶(PPCEs)，例如黑曲霉脯氨酸内肽酶(AnPEP)和neprosin，因在脯氨酸和丙氨酸后的高度选择性水解而脱颖而出。作者在研究中意外发现AnPEP对还原的半胱氨酸(Cys)也表现出特异性，并通过LC-MS系统分析了AnPEP的来源和影响其切割偏好的条件。这一发现对于重新定义PPCEs的水解偏好性、PPCEs在蛋白质水解中的应用以及重新审视这些蛋白酶的作用机制都具有重要意义。作者首先对固定化AnPEP在不同条件下对蛋白质混合物的在线酶切偏好性进行了分析，如图1a所示。在不同的流速和温度下，AnPEP对蛋白质混合物的酶切会受到实验条件的影响。除了对脯氨酸和丙氨酸进行特异性酶切外，AnPEP对半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸等其他氨基酸残基也具有一定的偏好性。作者还使用预先还原的人类血清评估了AnPEP对复杂生物样本中蛋白质的酶切偏好(图1b)。同样地，AnPEP在酶切过程中对脯氨酸、丙氨酸、半胱氨酸等残基具有较强的偏好性。
图1.固定化 AnPEP 的切割偏好分析。(a)在不同流速和/或温度下(黑色100 μL/min/21℃，橙色100 μL/min/2℃，灰色200 μL/min/2℃)和(b)已还原人血清(以100 μL/min /2℃进行水解)。
为了确证观察到的半胱氨酸酶切偏好性是AnPEP普遍存在的还是由于固定化或者不同来源的AnPEP等原因导致的特殊情况，作者比较两种不同的AnPEP酶在溶液中酶切蛋白质混合物时的酶切偏好性，分别是工业和食品补充剂级AnPEP。图2展示了两种酶在溶液中酶切预先还原的完整蛋白质混合物时的酶切偏好性。结果显示，两种酶在酶切时间和酶/蛋白比例变化时的酶切偏好性没有显著差异，其中特异性主要在脯氨酸和丙氨酸之后，但也显示出在半胱氨酸之后的显著切割偏好。这些结果说明，尽管两种酶来源于不同的产品，但它们在酶切蛋白质时的特异性相似。
图2.Clarity Ferm AnPEP 和ProAlanase 在溶液中的切割偏好比较。
之后，作者评估了不同状态下的半胱氨酸对AnPEP酶切偏好性的影响。结果显示，与未进行烷基化处理的样品相比，对蛋白质进行烷基化后AnPEP对Cys后酶切急剧减少，同时对Ala 和 Pro 酶切相应增加(图3)。这些结果解释了为什么以前的研究没有发现 对Cys的偏好性，因为之前的所有研究都进行了蛋白质还原和烷基化。图3.不同状态下的半胱氨酸对AnPEP酶切偏好性的影响：(a) 蛋白质混合物和(b)全细胞裂解物。最后，作者选用胰岛素进一步验证AnPEP对还原半胱氨酸的酶切活性(图4)。实验结果表明，在未还原的胰岛素中，AnPEP的酶切效果较差，这可能是由于胰岛素的紧密结构导致的。然而，当胰岛素被还原后，AnPEP能够在半胱氨酸位点进行有效切割。此外，对氧化的牛胰岛素β链的消化结果表明，氧化同样能够阻断AnPEP的切割活性，而主要的切割位点则转移到了脯氨酸和丙氨酸。
图4.使用胰岛素作为靶标验证还原型Cys的AnPEP水解特性：(a)未还原和(b)还原人胰岛素和(c)氧化的牛胰岛素β链的AnPEP酶切。
总的来说，本文系统地分析了AnPEP对还原半胱氨酸的水解特异性以及影响酶切偏好的条件，发现AnPEP对半胱氨酸的水解会被二硫键形成、氧化和烷基化等半胱氨酸修饰阻断。这项研究为蛋白质组学和相关生物化学研究提供了新的视角，重新定义了PPCEs的酶切偏好性，拓展了PPCEs的应用场景。美中不足的是，文章虽然提出了需要重新审视PPCEs的酶解机制，但并未深入探讨其具体的酶解机制。例如，对于PPCEs能够特异性水解还原型半胱氨酸的原因，文中没有提供详细的结构生物学分析或假设。这种特异性可能与酶的活性位点结构、底物结合口袋的构象以及酶与底物之间的相互作用有关，同时这种特异性与已知的Pro和Ala酶解机制之间的联系、是否存在共同的催化机制或底物识别模式等等，文章并未涉及这些方面。另外，本文在多种样本中验证了AnPEP对Cys的切割偏好，但对于更复杂的生物样本（如全细胞裂解液或组织样本），酶切特异性的表现可能会受到样本复杂性的影响。文中提到，在复杂样本中评估酶切偏好可能会高估酶的特异性，这表明在实际应用中，需要考虑对待样本复杂性对结果的影响。
文章引用：Postproline Cleaving Enzymes also Show Specificity to Reduced Cysteine
