分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Development of an Automated, Ultra-Rapid Bottom-Up Proteomics Workflow Utilizing Alginate-Based Hydrogels1，文章的通讯作者为加拿大不列颠哥伦比亚大学的Leonard J. Foster教授和菲莎河谷大学的Golfam Ghafourifar副教授。
自下而上蛋白质组学方法需要在质谱分析之前使用蛋白酶将蛋白质水解成更小、更易于分析的肽段。传统的酶解方法（溶液内和凝胶内）存在酶自溶、酶切时间长等挑战。为了解决了这些问题，涌现出许多固定化方法，如化学交联固定化酶、酶磁珠、固定化酶微反应器等。这些方法允许更高的酶与底物比，从而缩短了消化时间，同时允许酶的重复使用，但通常需要耗时的制造过程才能实现高酶密度。而藻酸盐基水凝胶则是一种快速而稳定的固定酶的方法。将酶包埋在由藻酸盐通过二价阳离子聚合形成的水凝胶基质中。研究人员首先测试了不同的水凝胶混合物比例，以便于形成和提高其稳定性。最终发现75%的藻酸盐混合物产生了最大且最坚固的水凝胶。然后选择在微量离心管内水凝胶介导的固定化和消化体系内进行研究，方案如图1所示。将甲酸注入海藻酸钠和碳酸钙溶液中，导致瞬间形成水凝胶。然后将 1 μL 酶注入水凝胶的中心，再添加底物得到约 1：2 的酶与底物比。消化一段时间后通过抽吸水凝胶表面附近的液体收集消化物进行LC-MS分析。
图1. 微量离心管内水凝胶介导的固定化和消化方案。
研究人员用胃蛋白酶进行初步优化，图2A显示过夜溶液中胃蛋白酶消化和1小时胃蛋白酶水凝胶消化之间的相似结果。图2B显示胃蛋白酶在室温（∼22 °C）和37 °C下的消化得到肽峰的数量或强度没有显着差异。此外，图2C显示使用胃蛋白酶水凝胶可实现短至 1 分钟的快速消化。图2D则比较胰蛋白酶水凝胶在消化时间（5至60分钟）条件下的结果，显示相似的肽图。由此得到的在水凝胶基质中进行单一酶消化的最佳程序是将1μL酶（∼1 mM）注入1.5 mL微量离心管中的40或80μL水凝胶中。然后，将26 μL变性底物（BSA，∼7mg/mL）轻轻添加到顶部，消化时间在1至60分钟之间，具体取决于所使用的酶。
图2. 通过毛细管电泳优化水凝胶介导的消化。
他们还研究了水凝胶中包埋的胃蛋白酶之间的动力学，绘制出胃蛋白酶（1µL，0.1mM）溶液（图3A）和水凝胶（图3B）消化BSA的米氏图（n=3），描述酶催化反应速率与底物浓度之间关系。图3C是水凝胶中胃蛋白酶和游离胃蛋白酶的最大反应速率、迈克尔常数、周转次数和催化效率汇总。水凝胶胃蛋白酶的周转次数比游离胃蛋白酶高7%，水凝胶胃蛋白酶的催化效率比游离胃蛋白酶高约120倍。这表明酶在水凝胶中的包埋不会对消化动力学产生负面影响，而且在低底物条件下，水凝胶的包埋大大提高了酶消化的效率。
图3. 水凝胶中包埋的胃蛋白酶之间的动力学。
接着评估了预制水凝胶的可重复使用性和储存。将水凝胶在室温下储存1 h、5 h、1天和8天，然后进行酶注射和随后消化酸变性 BSA。最后肽图在所有储存时间内保持一致，证明了室温储存的可行性。胃蛋白酶消化BSA后，对水凝胶进行洗涤以去除残留肽并防止污染。用100 μL水连续洗涤4次，通过CE分析上清液，显示在第一次和第二次洗涤后检测到肽，但在第三次洗涤后未检测到肽，表明两次洗涤足以完全去除残留肽。最后还通过胃蛋白酶多次1分钟的连续消化BSA来评估水凝胶包埋酶的可重复使用性，每次消化后进行洗涤。观察到酶活性在连续7次1分钟的消化后仍保持，即使在20次消化后也显示出显著的活性，但是消化效率有所降低。他们还使用 Bravo 液体处理器（Agilent Technologies，Waldbronn，德国）设计了一种水凝胶制备和酶解的自动化方法，液体处理器显著加快了水凝胶制备过程，能够同时制备 96 孔板（PCR-96-FS-C-S，Axygen）。
图4. 水凝胶制备和酶解的自动化。
还设计考察了一种利用移液器吸头的酶解方法。两种吸头内消解方案：滴注法和抽吸法。在滴注法中，用单独的移液管将 26 μL 底物添加到水凝胶上，并使其向下扩散。酶解后将酶解物通过吸头收集并储存。在抽吸法中，将水凝胶轻轻移动到移液器吸头的末端，然后吸取 26 μL 底物。然后让溶液消化，然后分液、收集并储存。这种方法应用于 Jurkat 细胞裂解物中，进行 15、30 和 60 分钟的消化。在三个消化时间之间，鉴定出的蛋白质有 87% 的重叠，其中 60 分钟法鉴定出最多的蛋白质（图5C）。
图5. 移液器吸头可实现基于水凝胶的原位酶解。
综上所述，本研究提出了一种快速的酶固定程序，可在几秒钟内形成酶基质。虽然海藻酸盐在以前的研究中已用于通过生物偶联固定酶和水凝胶内。然而，这个方法在速度、成本和简单性方面比传统方法具有明显的优势。包埋的酶水凝胶基质可以多次重复用于消化，从而节省了大量时间和成本。然而，目前的研究主要集中在胃蛋白酶和胰蛋白酶这两种常见的蛋白酶上，对于其他种类的蛋白酶在藻酸盐基水凝胶中的固定化效果、消化性能以及与不同蛋白质底物的兼容性等方面的研究还不够全面。在蛋白质组学研究中，不同的研究目的和样本类型可能需要使用多种不同的蛋白酶，因此可以进一步拓展该方法对更多种类酶的适用性。另外，文章中虽然详细介绍了藻酸盐基水凝胶的制备和应用过程，但在某些关键步骤的操作细节上，可能还需要进一步的补充说明。比如在水凝胶形成过程中对反应条件（如温度、搅拌速度等）的精确控制，以及酶注入水凝胶时的具体操作技巧和在基质中的存在形式与状态。另外还有酶切时底物的添加方式和扩散情况以及酶切后样品的收集方法也很重要。说明这些细节更有利于其他研究人员在不同条件下顺利重复该实验，并将其应用于更广泛的蛋白质组学研究中。
文章引用：Development of an Automated, Ultra-Rapid Bottom-Up Proteomics Workflow Utilizing Alginate-Based Hydrogels.
