酶是典型的绿色催化剂，然而，要充分实现其在生物技术中的潜力，通常需要改善其生物分子特性。催化活性的增强往往伴随着稳定性的下降。为了解决这一问题，Universidad de Granada的Jose M. Sanchez-Ruiz与其合作者通过结合核磁共振（NMR）技术和FuncLib计算两种最近提出的指导定向进化的方法，有效解决酶优化过程中活性与稳定性之间的相互作用问题。
图片来源：J. Am. Chem. Soc.
这项研究利用前期研究的从头设计Kemp消除酶对方法进行了测试，值得注意的是该酶在活性和稳定性方面已经高度优化。首先，利用核磁共振（NMR）技术确定蛋白质序列中可能影响催化的位点（催化热点）。通过过渡态类似物与目标酶结合引起的化学位移扰动，可以识别出这些催化热点。
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随后，将以上结果结合一种新颖的计算方法——FuncLib，该方法将Rosetta设计与系统发育分析相结合，根据预测的稳定性对包含多个突变的酶突变体进行排序。这一方法已在多种蛋白质设计应用中取得了成功。具体而言，在此利用FuncLib网络服务器的预测结果，针对NMR确定的催化热点进行靶向设计，以确保预测的突变体能够在调节酶活性的同时不损害其稳定性。
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结果显示，大多数测试的突变体显示出显著提高的变性温度和纯化产率。值得注意的是，最高效的工程突变体在已经高度优化的起始突变体基础上，活性提高了约3倍（kcat∼1700 s−1，kcat/KM∼4.3 × 105M−1s−1），成为迄今为止设计的最为高效的质子提取Kemp消除酶，其催化效率与天然存在的酶相当。
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此外，分子模拟实验表明，这种催化增强的根源在于逐步消除了原始设计中存在的催化效率低下的底物构象。值得注意的是，相互作用网络分析识别出了相当一部分催化热点，从而提供了一种计算工具，证明该工具即使在天然酶工程中也具有实用性。总体而言，这项工作展示了动态引导的酶工程作为设计原则的强大能力，用于获得具有定制理化特性的新型生物催化剂，甚至适用于人为反应。
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原文标题：Enzyme Enhancement Through Computational Stability Design Targeting NMR-Determined Catalytic Hotspots
原文作者：Luis I. Gutierrez-Rus,⧫Eva Vos,⧫David Pantoja-Uceda,⧫Gyula Hoffka, Jose Gutierrez-Cardenas, Mariano Ortega-Muñoz, Valeria A. Risso, Maria Angeles Jimenez,* Shina C. L. Kamerlin,* and Jose M. Sanchez-Ruiz*
https://doi.org/10.1021/jacs.4c09428
